Ziraat Türkiye Kupası play-off aşamasında; 2. kademe maçları sonucu tur atlayan 18 takım, 2009-2010 sezonunda Spor Toto Süper Lig'i 5-15 arasında tamamlayan 11 takım ve Spor Toto Süper Lig'e yükselen 3 takımın, tek maçlı eliminasyon sistemine göre mücadele ettiği play-off'ta şimdiye kadar Beypazarı Şekerspor, Gençlerbirliği, Konya Torku Şekerspor, Büyükşehir Belediyespor, Gaziantepspor, Denizlispor, MKE Ankaragücü, Bucaspor, Manisaspor, Gaziantep Büyükşehir Belediyespor, Kırıkhanspor, Medical Park Antalyaspor, Kasımpaşa ve Yeni Malatyaspor tur atlayarak gruplar kaldı.
Spor Toto Süper Lig'i ilk 3 sırada tamamlayan Bursaspor, Fenerbahçe ve Galatasaray ile 2010 Ziraat Türkiye Kupası şampiyonu Trabzonspor, kupaya grup aşamasından katılacak.